不同降溫速率對脂質(zhì)體懸浮液結(jié)晶的影響

利用自己研制的低溫顯微鏡研究脂質(zhì)體凍結(jié)過程中的冰晶生長圖像。圖 6-16 是海藻糖濃度為 0.05g/mL 的脂質(zhì)體懸浮液的慢速降溫過程的冰晶生長圖像，從圖中可以清晰地看出在此速率下形成的冰晶顆粒。圖 6-17 是快速降溫情況下的結(jié)晶圖像，與圖 6-16 相比，此時冰晶生長的速率非常快，在 1s 的時間內(nèi)，冰晶已占據(jù)了顯微鏡的整個視野，凍結(jié)幾乎是在一瞬間完成的。可以看到此時形成的冰晶非常細(xì)膩，用肉眼已看不到冰晶顆粒。

結(jié)晶過程可以認(rèn)為是由晶核形成和晶粒生長兩個過程組成的，分均相成核和異相成核。經(jīng)乳化后的水溶液可避免發(fā)生異相成核，因此脂質(zhì)體懸浮液的結(jié)晶屬均相成核。均相成核的晶核形成是由于溫度的下降，在液相內(nèi)的熱起伏即能量和密度的隨機(jī)漲落，使其內(nèi)的分子聚集而生成晶核，對于較稀的脂質(zhì)體懸浮液則是水分子的聚集形成冰晶晶核。在通常的過冷度范圍內(nèi)，隨著過冷度的增大，成核概率是隨著增大的，在較高的冷卻速率下，樣品的溫度下降快，樣品的凍結(jié)前已經(jīng)達(dá)到了較低的溫度，因此具有較大的過冷度，成核概率高，生成了比慢速降溫時更多的晶核；同時由于在單位體積內(nèi)的晶核數(shù)量多，冰晶的生長空間變得相對狹小，這樣就形成了圖 6-17 所示的快速降溫時的細(xì)膩的冰晶結(jié)構(gòu)。

凍干保護(hù)劑濃度對脂質(zhì)體懸浮液結(jié)晶的影響  

圖 6-18 是海藻糖濃度為 0.15g/mL 的脂質(zhì)體懸浮液凍結(jié)時冰晶的形成過程。凍結(jié)過程的降溫速率與圖 6-17 所示的海藻糖濃度為 0.05g/ml 的脂質(zhì)體懸浮液相當(dāng)，由圖可見這時晶體的生長速率明顯低于圖 6-17 所示的海藻糖濃度為 0.05g/ml的脂質(zhì)體懸浮液。顯然高濃度對冰晶的生長速率產(chǎn)生減慢的影響。

從冰晶生長的動力學(xué)過程來說，晶體要生長，則水分子必須要穿過固液界面加入到晶格中。為達(dá)到這個目的，水分子就需要有適當(dāng)?shù)目臻g指向、位置及能量。對于水這種強(qiáng)極性分子，大部分是以水分子鏈的形式存在的，因此在固化時，冰晶的生長不僅存在單個分子的集合，同時還包含有水分子集團(tuán)疊合，這就要求水分子集團(tuán)也能有一個理想的狀態(tài)，使其能加人到品格中而不會在品格內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)力。如果大部分的水分子集團(tuán)具有這種理想狀態(tài)，冰晶就能快速生長。在高濃度的脂質(zhì)體懸浮液中，大量的溶質(zhì)分子的存在極大地干擾了水分子集團(tuán)獲得這種理想狀態(tài)的能力，特別是在此時水分子較難獲得理想的空間指向，產(chǎn)生的結(jié)果就是降低了晶體生長的速率。比較圖 6-17 與圖 6-18 所示的冰晶生長圖像，可以看出隨著脂質(zhì)體懸浮液中海藻糖濃度的增大，冰晶生長速率降低。

凍結(jié)過程的冰晶生長與凍干品質(zhì)量之間的關(guān)系

利用程序降溫儀分別以20℃/min 和1℃/min 的降溫速率把海藻糖濃度為 0.1g/mL的脂質(zhì)體凍結(jié)到-65℃，然后在凍干機(jī)中凍干。上述不同降溫速率的脂質(zhì)體的凍干參數(shù)基本相同。凍干過程中真空度保持10Pa，在第一階段干燥過程中通過控制加熱板溫度防止脂質(zhì)體溫度過高；同時由于脂質(zhì)體中的自由水比較容易除去，此時冷阱溫度不需過低，在一60℃左右即可，在第二階段干燥過程中，脂質(zhì)體中的結(jié)合水較難除去，為了縮短凍干時間，必須適當(dāng)提高加熱板溫度，并降低冷阱溫度到-100℃左右，這樣便可增加脂質(zhì)體與冷阱表面間的水蒸氣壓力差，水蒸氣的凝結(jié)速率也就越大。從圖 6-19 所示不同降溫速率的凍干脂質(zhì)體外觀可以看出，降溫速率為 1℃/min 的凍干脂質(zhì)體產(chǎn)生塌陷和斷裂，而降溫速率為 20℃/min的凍干脂質(zhì)體外觀較好，將不同降溫速率的凍干脂質(zhì)體復(fù)水后，利用TSM超細(xì)顆粒粒度分析儀測試凍干前后脂質(zhì)體粒徑，如圖 6-20 所示。降溫速率為 20℃/min的凍干脂質(zhì)體粒徑變化較小，而降溫速率為 1℃/min的凍干脂質(zhì)體粒徑比凍干前增大，并且分布范圍變寬。

理論上在凍干過程中，樣品中大的冰晶不僅能加快熱量的傳遞，而且由于冰晶升華后形成大的孔洞，將有利于水蒸氣的逸出。但在相似的加熱板溫度和冷阱溫度下，在凍干過程中降溫速率為1℃/min 的脂質(zhì)體凍干時間比降溫速率為 20℃/min的脂質(zhì)體的凍干時間延長約40min。一方面是由于慢速降溫形成的表面濃縮層較厚，而在快速降溫過程中，冰晶細(xì)且生長速率快，濃縮的脂質(zhì)體來不及移動就被凍結(jié)，因此表面沒有形成濃縮層。另一方面由于隨著凍于過程的進(jìn)行，大的冰晶升華后留下的孔洞較大，形成的網(wǎng)狀骨架不能支承其本身的重量而塌陷，在表面形成硬殼，阻止水蒸氣的逸出，從而惡化了傳熱傳質(zhì)，使凍干時間延長，同時也使脂質(zhì)體的粒徑增大，降低了凍干脂質(zhì)體的臨床應(yīng)用效果。

快速降溫的脂質(zhì)體的冰晶比較細(xì)膩，表面沒有濃縮層，并且冰晶升華后形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠支承本身的重量而不塌陷，水蒸氣能順利逸出，因此快速降溫不僅能減少凍干時間，而且凍干脂質(zhì)體復(fù)水后囊泡的粒徑變化較少。